产品介绍
BCA蛋白定量试剂盒
产品简介：
目前世界上常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA 法与传统方法相比更简单、更稳定、更灵敏度。BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，对于5%以内的SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80具有很好的兼容性,但BCA法测定蛋白浓度易受螯合剂、高浓度的还原剂等的影响，在BCA法测定蛋白浓度前应尽量使：EDTA浓度≤m10M，DTT浓度≤1mM，2-ME≤0.01%。
Leagene BCA Protein Assay Kit在50～1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系， 其小检出量为25μg/ml。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
自备材料：
1、酶标仪或分光光度计
2、96孔板或EP管
3、恒温箱或水浴锅
操作步骤(仅供参考)：
1、取1ml蛋白标准配制液完全加入到含有20mg的蛋白标准(BSA)中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白标准溶液应-20℃保存。
2、取适量的20mg/ml蛋白标准溶液，稀释至终浓度为500μg/ml或所需浓度。如取25μl 蛋白标准(20mg/ml)，加入975μl稀释液，充分混匀即配制成500μg/ml蛋白标准溶液。注意：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，一般可用0.9%NaCl或PBS作为溶解BSA稀释液，稀释后的500μg/ml蛋白标准溶液也应-20℃长期保存。
3、根据样品数量，按试剂(A):试剂(B)=50:1的比例配制BCA工作液，即取50份BCA试剂A和1份BCA试剂B，充分混匀，即获得BCA工作液(注意：正常BCA工作液应为苹果绿或墨绿色，如变为紫色或其他颜色应弃用)。例如取5ml BCA试剂A和0.1ml BCA试剂B，配制成5.1ml BCA工作液，BCA工作液室温24小时内稳定。
4、将500μg/ml蛋白标准溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板或EP管中，加稀释液补足至20μl，其蛋白标准浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
5、加20μl待测蛋白到96孔板或EP管中，如果样本不足20μl，用稀释液补足至20μl。注意：如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液不同，应在待测蛋白中加入20μl稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白的溶液相同，无需在待测蛋白孔中加入20μl稀释液，以减少不同溶液的差异。
6、向各孔或EP管加入200μl配制好的BCA工作液，37℃孵育20～30min。
7、酶标仪或分光光度计测定562nm波长处吸光度(如无562nm，540～595nm之间的波长也可)，各孔或EP管吸光度减去未加500μg/ml蛋白标准溶液的吸光度，以求得的差值为纵坐标：以标准孔或EP管中蛋白浓度(μg/ml)为横坐标，得出标准曲线及回归方程，根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度。注意事项：
1、蛋白标准(BSA)粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液(即20mg/ml的蛋白标准)，该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存。
2、待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
3、如果检测效果不佳，可以室温放置2h或60℃放置30min，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随温度升高而加快；如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
4、测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质。
5、BCA法检测时，待测样本中不应含有EGTA，否则影响检测结果。
6、因BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，建议每次测定时都作标准曲线，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。
7、如果没酶标仪，也可用普通分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的小测定体积，应按比例适当加大BCA工作液的用量使总体积不小于小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大；使用分光光度计测定蛋白浓度时，可以测定的样品数量可能会显著减少，Leagene建议把系列标准品用量增加至100μl，BCA工作液用量增加至1ml。
8、为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当加热，但是切勿过热，否则易失效。
有效期： 12个月有效。蛋白标准配制成溶液后应-20℃冻存。
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